Флуоресцентный микроскоп
Флуоресцентный микроскоп (лат. fluo — течь, греч. μικρός — маленький и греч. σκοπέω — смотрю) — специализированный оптический микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флуоресценции (люминесценции). При этом возможно проводить исследования образцов под действием УФ-излучения в проходящем или отражённом освещении.[1][2]
В основе Флуоресцентный микроскопии лежит метод, впервые сформулированный и защищённый авторским свидетельством российским физиком Андреем Климовым, позволяющий существенно увеличить разрешение оптических микроскопов[3]. Однако, патент (который оспаривается) принадлежит разработчику и создателю Флуоресцентного микроскопа Штефану Хеллу (Stefan Hell) из Института биофизической химии (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry (Karl Friedrich Bonhoeffer Institute)) — 2006 год. Большинство Флуоресцентных микроскопов предназначены для исследований в отражённом свете. Эти микроскопы стали важным инструментом в области биологии, открывая возможности для более передовых направлений микроскопии, типа конфокальной микроскопии позволяющий получать изображения не только с поверхности, но и с некоторой глубины образца.
ОписаниеПравить
Процесс поглощения энергии фотонов органическими и неорганическими веществами, с последующим испусканием лучей, имеющих большую длину волны, известен как явление флуоресценции (свечения). Эмиссия света образцом, после облучения более коротковолновым излучением, появляется одновременно с началом поглощения возбуждающего излучения. При этом излучение имеет большую длину волны, чем возбуждающее излучение. В случае, когда время свечения после прекращения возбуждающего излучения составляет более микросекунды, процесс называется фосфоресценцией.
Впервые это явление было открыто и описано англичанином Джордж Стокс Г. в 1852 году. Он заметил, что минерал флюорит начинал светиться красноватым светом, при освещении его ультрафиолетовыми лучами. Дальнейшие исследования показали, что многие объекты: органические и неорганические вещества, кристаллы, смолы, масла, хлорофилл, витамины и др. флюоресцируют при освещении их ультрафиолетовыми лучами. Лишь с 1930 годов началось использование явления флюоресценции в биологических исследованиях. Исследуемые элементы (ткани, бактерии, болезнетворные микроорганизмы и пр.) для их выявления стали окрашивать флуоресцирующими красителями. Это послужило толчком к созданию метода флуоресцентной микроскопии.
Основной принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца заданной определенной полосой длин волн вызывающих флуоресценцию образца. Затем необходимо выделить намного более слабое излучение флуоресценции. В идеально настроенном микроскопе, только свет от флуоресценции должен достичь глаза исследователя или детектора так, чтобы в результате флуоресцентные структуры выделялись с высокой контрастностью на очень темном (или черном) фоне. Проблема состоит в том, что свет возбуждения, как правило, в несколько сотен тысяч, а иногда и в миллион раз ярче, чем свет излучаемой флуоресценции. На рисунке показана схема (в разрезе) современного флуоресцентного микроскопа для проведения исследований в проходящем и отражённом свете.
Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа состоит из источника ультрафиолетового излучения, возбуждающего и запирающего светофильтров, теплового (теплозащитного) фильтра и специального люминесцентного объектива. Источник света излучает волны в ультрафиолетовой области спектра, которые проходят через фильтр, где отсекаются волны другого спектрального ряда. Ультрафиолетовые лучи попадают на изучаемый препарат и вызывают его люминесценцию. Свет люминесценции проходит через запирающий фильтр, который не пропускает свет возбуждения (ультрафиолетовые волны) и далее формирует изображение в объективе. Для проведения флуоресцентной микроскопии используют метод освещения препарата в проходящем свете и метод освещения в падающем свете.
Следует отметить, что флуоресценция является единственным способом в оптической микроскопии, при которой образец, после возбуждения, сам излучает свет. При этом свет излучается сферически во всех направлениях, независимо от направления источника возбуждающего света.