Церулоплазмин

Эта статья должна быть полностью переписана. На странице обсуждения могут быть пояснения.

Эту статью следует викифицировать. Пожалуйста, оформите её согласно общим правилам и указаниям.

Физико-химические свойства и структура церулоплазмина.

Церулоплазмин (ЦП) был впервые описан шведскими учеными Холмбергом и Лауреллом в 1944 году [Holmberg, 1944]. Спустя несколько лет он был подробно охарактеризован и получил свое название, означающее «небесно-голубой белок плазмы» [Holmberg and Laurell, 1948; Holmberg and Laurell, 1951]. ЦП — медьсодержащий гликопротеид, относящийся к 2-глобулиновой фракции плазмы крови позвоночных. С аминокислотными остатками (а.о.) молекулы ЦП прочно связано 6 ионов меди [Zaitseva et al., 1996]. ЦП человека состоит из одной полипептидной цепи [Ryden, 1971]. Ее длина, как показало определение первичной структуры белка, составляет 1046 а.о. и может быть разделена на три гомологичных купредоксидовых домена [Ortel et al., 1984]. Однако, традиционно каждый из купредоксидновых доменов разделяют на два, таким образом молекула ЦП состоит из 6 гомологичных доменов (Рис. 1).

Изображение:copper3.jpg

Рис. 1. Модели холо-ЦП (А) и апо-ЦП (Б) [Vachette et al., 2002]. В изоформе II домены выделены: 1 и 2 — оранжевым, 3 и 4 — желтым, 5 и 6 — синим. В, Г. Схема распределения ионов меди I (синие: a, b, c), II (голубой) и III типа (желтые) между доменами в проекции на молекулу ЦП (В) [Farver et al., 1999] и по длине полипептидной цепи (Г) [Ortel et al., 1984]. Углеводные цепи обозначены зигзагами, в изоформе II отсутствует углеводная цепь в конце 2 домена. Суммарная молекулярная масса (М) а.о. ЦП — 120085 Да, а М молекулы в целом, с учетом углеводных цепей и ионов меди — около 132 кДа. По данным исследования кристаллов М (ЦП) ~ 132*4 кДа [Magdoff-Fairchild et al., 1969]. При хроматографии на гидроксилапатите разделяются две изоформы ЦП [Broman, 1958]. В преобладающей изоформе I присутствуют четыре, а в изоформе II — три олигосахаридные цепи. Олигосахара присоединены к белковой цепи N гликозидной связью с остатками аспарагина 179, 339 (только в изоформе I), 378 и 743 [Takahashi, 1984]/ Полипептидная цепь ЦП человека легко фрагментируется в реакции ограниченного протеолиза [Ryden, 1971; Sang, 1995], причем ее разрыв происходит всегда по определенным пептидным связям, что приводит часто к образованию одних и тех же фрагментов (Рис. 2).

Изображение:Proteolysis.jpg

Рис. 2. Схема протеолитического расщепления трипсином полипептидной цепи ЦП человека на фрагменты [Ortel et al., 1984]. С помощью сайт-направленного мутагенеза по K887, R 701 и R 481 был получен ЦП человека, устойчивый к протеолизу [Bielli et al., 2001]. Следует отметить, что разрыв полипептидной цепи ЦП вовсе не означает, что протеолитические фрагменты легко отделяются от молекулы ЦП: для выявления фрагментов при SDS-ЭФ в ПААГ необходимо восстановить дисульфидные связи, а для препаративного разделения — обработать мочевиной или гуанидином [Prozorovski et al., 1982]. При ограниченном трипсинолизе ЦП быка и человека различались по динамике и фрагментам гидролиза [Boivin et al., 2001]. Показано, что ЦП крысы [Ryan et al., 1992] и дельфина [Bonaccorsi di Patti et al., 1992; Calabrese et al., 1997; Захарова и др., 2002] устойчивее к протеолитическим ферментам, чем ЦП человека.

Ионы меди и строение активного центра церулоплазмина

Ионы меди в составе белков по спектральным свойствам делятся на три группы. Ионы меди I типа характеризуются сильным поглощением в области около 600 нм (максимум поглощения ЦП находится при 610 нм), в результате белки, их содержащие, приобретают интенсивную голубую окраску. Ион меди I типа имеет в качестве обязательных лигандов два атома азота имидазолов гистидина и атом серы цистеина. Как правило, в качестве четвертого лиганда выступает еще один атом серы метионина. Весь центр связывания Cu+2 I типа имеет форму неправильного тетраэдра, что, вероятно, является компромиссом между формой полноценного тетраэдра, характерной для Cu+, и квадратно-плоскостной координацией Cu+2 в составе низкомолекулярных комплексов меди или неголубых медьпротеидов [Lu et al., 1993]. Скорее всего, требуя наименьших энергетических затрат на реорганизацию центра, такая форма обеспечивает необычайно быстрые переходы иона меди I типа из одного состояния окисления в другое и обратно, что, в свою очередь, дает голубым белкам возможность эффективно участвовать в реакциях переноса электронов. Спектральные характеристики ионов Cu+2 II типа, входящих в состав белков, близки к таковым у низкомолекулярных комплексов меди, имеющих бледно-голубое окрашивание, благодаря d-d переходам в области 600—800 нм спектра поглощения Cu+2. После получения четкого сигнала ЭПР стало ясно, что в роли лигандов иона меди II типа в белках выступают четыре атома азота имидазольных колец His [Dawson et al., 1979]. В отличие от Cu+2 II типа, ионы меди III типа имеют ряд специфических спектральных характеристик, что вызвано особенностями их лигандирования. Эти ионы существуют в виде пар, расстояние между ионами обычно находится в пределах 0.34-0.45 нм [Brown et al., 1980], так что неспаренные электроны внешнего уровня имеют взаимно компенсированные спины. Поэтому в своем обычном состоянии Cu+2 III типа не дают вклада в спектр ЭПР, они имеют характерную полосу с максимумом поглощения при 330—340 нм [Beltramini et al., 1990]. Как и Cu+2 II типа, ионы меди III типа лигандируются атомами азота имидазолов гистидина. Для образования центра связывания ионов меди III типа белковая глобула должна иметь своеобразный гистидиновый кластер, в котором неоднократно встречается последовательность H-X-H [Messerschmidt and Huber, 1990]. Согласно данным кристаллографических исследований, молекула ЦП содержит 6 прочно связанных ионов меди всех трех типов [Zaitseva et al., 1996]. Три из них — ионы «голубой» меди, один — Cu+2 II типа, оставшиеся два составляют диамагнитный центр III типа. Распределение их по доменам показано на Рис. 1, В, Г. Диамагнитная пара ионов меди III типа обеспечивает сохранение стабильной структуры молекулы ЦП [Vachette et al., 2002], играя роль «застежки» в холо-ЦП (Рис. 1, А, Б). Низкоаффинное связывание седьмого иона меди, экспонированного на молекуле ЦП, обеспечивает H426 [Mukhopadhyay et al., 1997] этому иону приписывают прооксидантные свойства.

Организация и экспрессия гена церулоплазмина

Ген ЦП протяженностью в 65 т.п.н. локализован в хромосоме 3.q23-q24 и содержит 20 экзонов [Diamon et al., 1995]. Анализ 5`-фланкирующего региона гена ЦП крысы показал наличие сайтов TATAAA (-30) и AACCAATCT (-102) [Fleming and Gitlin, 1992]. В гепатоцитах в результате альтернативного сплайсинга образуется два вида иРНК размером 4.2 и 3.7 т. н., различающихся длиной полиаденилового кластера [Yang et al., 1986]. Синтез ЦП регулируется на уровне иРНК (Рис. 3) белковым фактором, связывающимся с полиаденилированным концом (PABP) и эукариотическим фактором инициации транскрипции eIF4G [Mazumder et al., 2001].

Рис. 3. Регуляция синтеза ЦП на уровне иРНК [Mazumder et al., 2001]. 3`-UTR — 3`-нетранслируемый регион, 5`-UTR — 5`-нетранслируемый регион, Cp-TI — ингибитор трансляции ЦП, eIF — эукариотические факторы инициации трансляции, PABP — белок, связывающийся с полиаденилированной последовательностью (poly(A)). А — «замкнутая петля» PABP связан с poly(A) и eIF4G, B — ингибирование синтеза ЦП: Cp-TI нарушает связывание PABP с poly(A) (1) и eIF4G (2), C — ингибирование синтеза ЦП: Cp-TI нарушает иниционный комплекс (3).

Концентрация ЦП в крови повышается во время воспаления, инфекции и продолжительных травматических состояний в результате активации транскрипции гена ЦП, индуцированной гамма-интерфероном [Mazumder et al., 1997] и цитокинами [Gitlin, 1988]. При дефиците железа происходит активация транскрипции гена ЦП фактором, индуцируемым гипоксией (HIF-1), который также активирует гены эритропоэтина, оксигеназы-1 гема, трансферрина и его рецептора [Mukhopadhyay et al., 2000]. Недавние исследования показали, что гамма-интерферон после активации синтеза ЦП снижает активность его трансляции с помощью неканонической функции глутамил-пролил-тРНК-синтетазы (Рис. 4) [Sampath et al., 2003, Sampath et al., 2004].

Изображение:TRNA.jpg

Рис. 4. Регуляция синтеза ЦП гамма-интерфероном [Sampath et al., 2004]. P-GluProRS — фосфорилированная глутамил-пролил-тРНК-синтетаза, GAIT — гамма-интерферон активируемый ингибитор трансляции, GAPDH — глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, L13a — белок рибосомы, NSAP 1 — NS1-ассоциированный белок 1.

При действии гамма-интерферона за первые 4 часа глутамил-пролил-тРНК-синтетаза (P-GluProRS) фосфорилируется и выходит из мультикомпонентного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз и соединяется с рибонуклеарным белком Q1 (NSAP 1). Через 12 часов происходит связывание с фосфорилированным рибосомальным белком L13a и с глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназой (GAPDH). Такой комплекс, называемый гамма-интерферон активируемым ингибитором трансляции (GAIT), ингибирует трансляцию ЦП при связывании с GAIT элементом на 3`-конце иРНК ЦП. На мембране клеток ЦНС (астроцитов, лептоминингеальных клеток) и клеткок Сертоли находится ЦП с GPI-якорем на С-конце, образовавшийся в результате альтернативного сплайсинга между 19 и 20 экзонами (Рис.5). Это, вероятно, связано с необходимостью осуществления функций, присущих ЦП, в районах, отграниченных от поступления ЦП крови гематоэнцефалическим и гематотестикулярным барьерами [Patel et al., 2000; Mittal et al., 2003; Fornta et al., 1999]. Экспрессия ЦП в ЦНС продемонстрирована в основных структурах мозга, в том числе в сетчатке глаза [Klomp et al., 1996; Klomp and Gitlin, 1996].

Изображение:Spl.jpg

Рис. 5. Изменение С-концевой последовательности ЦП в результате альтернативного сплайсинга [Patel et al., 2000]. Подчеркнута сигнальная последовательность присоединения GPI-якоря.

GPI-форма ЦП сетчатки, вероятно, противостоит вызванному квантами света окислительному стрессу, так как уровень ЦП-мРНК возрастал в 8 раз после освещения сетчатки. ЦП был выявлен во всех типах клеток сетчатки и превосходил количество ЦП, найденное в остальных структурах мозга [Chen et al., 2003]. При травмах мозга у мышей уровень GPI-ЦП на астроцитах увеличивается под действием интерлейкина 1бетаIL-1бета), даже у животных с дефицитом рецепторов IL-1 [Kuhlov et al., 2003]. В эндоплазматическом ретикулуме происходит N-гликозилирование ЦП. Встраивание в ЦП ионов меди, вероятно, происходит в транс-сети аппарата Гольджи. Рецепторы для ЦП выявлены на клетках аорты и сердца цыплят [Stevens et al., 1984], эритроцитах [Barnes and Friden, 1984], моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах [Kataoka & Tavassoli, 1985], эндотелии печени и клетках Купффера [Kataoka and Tavassoli, 1984], а также яйцеклетках [Orena et al., 1986].

Участие церулоплазмина в метаболизме меди

Уже довольно давно было высказано предположение о способности ЦП транспортировать в организме медь [Broman, 1967]. В пользу этого говорит тот факт, что большая доля ионов меди в плазме крови (до 95 %) входит в состав ЦП [Magdoff-Fairchild et al., 1969]. До недавнего времени считалось, что за исключением доставки меди, поступающей в русло крови и печень (при котором медь связана с альбумином и некоторыми низкомолекулярными соединениями), весь транспорт меди — между печенью и другими органами — осуществляется ЦП [Marceau and Aspin, 1972]. Последующие наблюдения поставили под сомнение справедливость этой гипотезы. Исследования на мышах с ацерулоплазминемией с применением 64Cu меток показали, что ЦП не играет критической роли ни при абсорбции, ни при экскреции меди организмом [Meyer et al., 2001]. И все же ЦП маркирует нарушения обмена меди. Ниже будет рассмотрена роль ЦП как связующего звена метаболизма меди и железа. После поглощения ионов меди энтероцитами и поступления в кровяное русло, медь, находясь в комплексах с белками плазмы, пептидами и аминокислотами, поступает в гепатоциты с помощью транспортера ионов меди hCtr1, активность которого ингибируется ионами Cd2+, Mn2+, Zn2+ и Co2+. В цитоплазме гепатоцита медь распределяется между шаперонами (HCOX17, HAH1/Atox1, hCCS), которые распределяют медь по клеточным депо, расходующим ее по мере синтеза медьсодержащих белков. HAH1/Atox1 поставляет ионы меди АТФ-азе Р-типа (ATP7B), находящейся в транс-Гольджи сети, ген которой локализован в 13 хромосоме. ATP7B встраивает ионы меди в ЦП, обеспечивает их экскрецию вместе с желчью и везикулярный транспорт ионов меди. В цитоплазме ионы меди находятся в комплексе с глутатионом (GSH), который препятствует токсическому действию активных форм кислорода. Механизмы секреции меди с желчью еще не разъяснены до конца. Вероятно, секреция осуществляется двумя путями: везикулярный транспорт, который можно ингибировать с помощью колхицина, и опосредованный канальцевым транспортером органических анионов (сМОАТ) транспорт медного комплекса GSH [Fuentealba and Aburto, 2003].

Участие церулоплазмина в метаболизме железа

Уже 70 лет назад впервые было отмечено, что при недостаточном поступлении меди в организм животные страдали анемией [Hart et al., 1928]. У животных, содержавшихся на медьдефицитной диете, через некоторое время наступало уменьшение концентрации сывороточного железа и меди эритроцитов, а затем резко снижалось количество эритроцитов в крови [Lahey et al., 1952]. После того, как была подробно изучена способность ЦП окислять Fe2+ до Fe3+ и доказано физиологическое значение этой реакции [Osaki, 1966], белок получил также систематическое название согласно Международной Классификации Ферментов — «ферро:О2-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1». Часто используется более короткое название — ферроксидаза. Обнаружение ферроксидазной активности ЦП позволило предположить, что этот фермент является связующим звеном между обменом железа и меди. Среди всех субстратов ЦП минимальное значение Km ~ 0.65 мкМ найдено для Fe2+ [Osaki, 1966]. Было показано, что измерение скорости встраивания Fe3+ в апо-ТФ может быть использовано для количественной оценки оксидазной активности ЦП. Кроме того, при использовании Fe2+ в сыворотке крови человека при рН 7.4 формируется Fe3±ТФ, однако, без участия ЦП за сутки в ТФ встраивается 3-5 мг Fe3+ против 60 мг в присутствии ЦП [Frieden and Hsieh, 1976]. Учитывая суточную потребность в железе для человека (35-40 мг), можно сделать вывод, что ЦП необходим для поддержания нормального уровня окисленного железа в плазме крови (Рис. 6, А). Железо, присутствующее в пищевых продуктах в закисной (Fe2+) и окисной (Fe3+) формах, для поглощения мембраной энтероцита должно восстановиться до Fe2+ [Зайчик и Чурилов, 2001]. В щеточной каемке энтероцита присутствует апикальная мембранная редуктаза (FeR) и связанный с ней транспортер двухвалентных металлов DMT1 (Nramp2, DCT1, SLC11A2), которые осуществляют абсорбцию железа в тонком кишечнике. На базолатеральной мембране энтероцита присутствует другой транспортер железа — IREG1 (MTP1, ферропортин 1, SLC11A3), способствующий переносу Fe2+, которое затем окисляется гомологом ЦП — гефестином, встроенным в мембрану. Мутация в гене IREG1 (локализация — 2q32) ведет к гемохроматозу [Roy and Andrews, 2001]. Гефестин (локализация — Xq11-q12) принадлежит вместе с ЦП к одному суперсемейству белков. Структура гефестина (1158 а.о.), смоделированная по третичной структуре ЦП и данным о последовательности кДНК, содержит гомологичный ЦП активный центр и участки связывания меди [Syed et al., 2002]. В отличие от ЦП, в молекуле гефестина один из доменов является трансмембранным [Anderson et al., 2002]. У мышей, сцепленная с полом мутация в гене гефестина (sla), приводит к дефициту железа и анемии. Эксперименты на мышах с мутациями белков абсорбции железа и мышах дикого типа, содержавшихся на железодефицитной диете, показали, что DMT1 модулирует ответ на местные сигналы содержания железа, тогда как экспрессия генов IREG1 и гефестина увеличивается в ответ на системные изменения уровня железа [Chen et al., 2003]. Таким образом, потребность организма в железе, в первую очередь, отражается на апикальных белках энтероцита, а затем детерминирует экспрессию белков базолатеральной мембраны. Содержание железа в цитоплазме энтероцита контролирует активность транспортера DMT1 [Anderson et al., 2002]. Эксперименты по передаче микроэлементов плоду от матери, находившейся на железо- и медьдефицитной диете, показали, что материнский организм минимизирует дефицит за счет увеличения экспрессии рецептора трансферрина, гефестина, а также увеличения содержания меди в печени, сыворотке и плаценте матери [Gambling et al., 2003]. У крыс, содержавшихся на железодефицитной диете, показано увеличение иРНК гефестина [Sakakibara and Aoyama, 2002]. Плацентарная медьсодержащая оксидаза (ПМСО) была изучена на культуре клеток BeWo плацентарного трофобласта человека, используемой как модель транспорта железа и меди. Подобно гефестину, ПМСО является мембраносвязанным 140 кДа-белком, обладающим пара-фенилендиамин-(ПФД)-оксидазной активностью и реагирующим с антителами к ЦП. ПМСО является критическим звеном в обмене железа и меди клетками плаценты [Danzeisen et al., 2002].

Изображение:Femet.jpg

Рис. 6. Участие ЦП в метаболизме железа в крови (А) и нервной системе (Б) [Harris et al., 1998]. ГБ — гемоглобин, ТФ — трансферрин, ТФR — рецептор трансферрина, ФРТ — ферритин, NO-С — NO-синтетаза.

GPI-заякоренный ЦП астроцитов физически связан с транспортером двухвалентных металлов, IREG1, который не способен в отсутствии ЦП транспортировать железо из астроцита (Рис. 6, Б). Другой транспортер Fe2+, DMT1, в нервной ткани опосредует отток железа в глиальные клетки от астроцитов [Jeong and David, 2003]. Подтверждением тесной зависимости обмена железа от ЦП у человека является ацерулоплазминемия, заболевание, вызванное мутацией в гене ЦП, приводящей к утрате ферментативной активности ЦП. При этой мутации резко снижена оксидазная активность белка, что вызывает гемосидероз с обширными отложениями железа в тканях различных органов [Yosida et al., 1995]. Некоторые ионы тяжелых металлов вызывают снижение активности ЦП в сыворотке крови. Эффективность этих ионов в порядке убывания следующая: Ag+>Cd2+>Mo6+>Zn2+ [Whanger and Weswig, 1970]. Из приведенных выше примеров видно, что ЦП занимает связующую позицию в метаболизме меди и железа — двух важнейших микроэлементов в организме млекопитающих.

Ферментативная активность церулоплазмина: антиоксидант и прооксидант

В конце 70-х годов появились первые сообщения о способности ЦП играть роль скавенджера супероксидных анион-радикалов (О2•) [Goldstein et al., 1979]. При этом действие фермента, как выяснилось, не зависит от его взаимодействия с веществами, предварительно восстановленными О2•, а скорее от взаимодействия с самим О2•, которое сходно по ряду параметров с действием супероксиддисмутазы. Позже Bannister и соавторы [Bannister et al., 1980] сделали вывод, что они наблюдали в экспериментах обычную реакцию окисления О2• ферментом-оксидазой (ЦП), описываемую следующим уравнением: 4O2• + 4H+ + O2 = 4O2 + 2H2O, тогда как реакция истинного дисмутирования, катализируемая супероксиддисмутазой, отличается тем, что место кислорода в ней занимает О2•, и уравнение принимает следующий вид: 3O2• + 4H+ + 2O2 = 3O2 + 2H2O2. Также ЦП препятствует накоплению и действию токсических окисляющих радикалов в плазме крови за счет ферроксидазной активности: 4Cu(II) + 4Fe2+ = 4Cu(I) + 4Fe3+; 4Cu(I) + O2 + 4H+ = 4Cu(II) + 2H2O. Катализируя окисление Fe2+ до Fe3+, фермент поддерживает соотношение Fe2+:О2 равным 4:1, обеспечивая четырехэлектронный перенос на О2 с образованной воды, предотвращая неферментативную реакцию, в результате которой образуется О2•: Fe2+ + О2 = Fe3+ + О2•. Окисляя Fe2+ до Fe3+, ЦП может препятствовать реакции Фентона: образования OH• радикалов при взаимодействии Fe2+ c H2O2: Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH•. С помощью сайт-направленного мутагенеза для ферроксидазной реакции доказана важность а.о.: E633, E567, H602, E935 и H940 [Brown et al., 2002].

Изображение:Divalent.jpg

Рис. 7. Модель переноса электрона с двухвалентного катиона (M2+) на ион Cu I типа в ЦП [Quintanar et al., 2004].

Связывание ионов Fe2+ в лабильном сайте ЦП и перенос электрона на ион меди I типа является критическим этапом осуществления ферроксидазной реакции (Рис. 7). С помощью метода спектроскопии кругового дихроизма с переменными температурой и магнитным полем были изучены электронная структура и геометрия сайта для связывания Fe2+ в ЦП, его гомологе Fet3 (Saccharomyces cerevisiae) и мутантных формах белка с аминокислотными заменами в лабильном сайте, что позволило построить модель переноса электрона с Fe2+ на ион Cu I типа [Quintanar et al., 2004]. Способствуя встраиванию в ферритин окисленного Fe3+, ЦП ингибирует супероксидное и ферритин-зависимое перекисное окисление липидов (ПОЛ) [Samokyszyn et al., 1989]. Описанные выше свойства ЦП послужили основой для объяснения его противовоспалительной активности, что вместе с быстрым возрастанием концентрации ЦП (в 2-3 раза) в русле крови уже в начале воспа