Цветные реакции для определения грибов

Химические цветные реакции — один из методов идентификации грибов, прежде всего макромицетов. Химический метод исследования, основанный на наблюдениях изменений окраски различных макро- и микроскопических структур грибов под действием реактивов используется при идентификации образцов, в том числе для различения таксономических групп.

Таксономическим признаком может служить как положительный или отрицательный результат химического исследования, так и вариации в изменении окраски при положительных реакциях, поскольку один и тот же реактив может давать разное окрашивание у разных видов грибов.

Могут проводиться простые тесты по выявлению характерных реакций мякоти плодового тела в целом или микроскопические исследования, обнаруживающие цветные реакции гиф, спор, базидий и других элементов трамы или мицелия (см. Красители для микроскопии).

Исследования могут проводиться на свежесобранных экземплярах грибов, а некоторые и на гербарных образцах.

Значение и история метода

Макроскопические признаки плодовых тел, а иногда и признаки, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании могут быть недостаточными для однозначного определения. В таких случаях используют цветные химические реакции как дополнительный критерий таксонов.

Вильям Нюландер (1822—1899), финский ботаник и энтомолог, первооткрыватель химического метода исследования грибов

Применяемые аналитические реактивы в большинстве случаев не являются специфическими для определённых веществ или комплексов веществ, содержащихся в грибах, однако они часто оказываются специфичными для определённых таксонов грибов, что и позволяет широко использовать метод. Некоторые из используемых реакций являются специфическими, например, положительная реакция с бензидином и α-нафтолом указывает на наличие в мякоти гриба фермента лакказы, с фенолом — тирозиназы, а тест на амилоидность позволяет не только определить наличие в клетках специфичных полисахаридов (глюканов), но и сделать определённые выводы о строении их макромолекул.

Впервые химический метод был применён в 1866 году финским ботаником Вильямом Нюландером (1822—1899) для систематики лишайников. Нюландер заметил, что разные виды по-разному реагируют на воздействие растворами щелочей, гипохлоритов, иода, солей железа и другими реактивами.

Позже Мюллер изучал действие химических реактивов на полипоровые грибы и обнаружил появление фиолетовой окраски у Hapalopilus nidulans, Харлей открыл исчезновение фиолетовой окраски мякоти груздя чёрного под действием щёлочи. В течение всего XX века действие химических реактивов на грибы изучалось многими известными микологами (В. Мельцер, 1924; Ю. Шеффер и Ф. Мёллер, 1938; Р. Кюнер и А. Романьези, 1953; Р. Зингер, 1951, 1962, 1969, 1975; А. Майкснер, 1975; С. П. Вассер, 1980, 1992). Наиболее полные данные о химических цветовых реакциях баздиальных грибов содержатся в работах Кюнера и Романьези, Зингера (1975), Майкснера, Вассера. Для лишайников химический метод углублённо изучался в 1930-х годах японским микологом Я. Асахиной и подробно описан А. Н. Окснером.

В отношении самого́ химического метода среди микологов существуют два противоположных мнения:

• На основании только химических реакций описываются новые таксоны, иногда даже роды, при этом совершенно не учитываются другие критерии, особенно условия произрастания грибов.
• Некоторые же учёные не придают значения методу как дополнительному критерию таксонов.

С. П. Вассер приводит две цитаты, характеризующие оба существующих подхода:

Время от времени делаются попытки использования химических опытов для определения видов грибов и лишайников, что часто вызывает бурю протестов. Однако в группе, которая представляет трудность для классификации и количество признаков которой невелико или, наоборот, очень разнообразно, поступление дополнительных сведений должно только приветствоваться.

— А. Берджес

Химический метод как один из удобных, быстрых и надёжных, как дающий дополнительную информацию в суждениях о виде и других таксонах, следует широко использовать, но непременно вместе с другими методами систематики, особенно морфологическими.

— А. Н. Окснер, Определитель лишайников СССР. Морфология, систематика и географическое распространение

Часто используемые реактивы

Результаты исследования часто записываются в кратком виде с использованием химических формул (для неорганических реактивов) или сокращённых обозначений, которые могут различаться у разных авторов, поэтому в публикациях приводятся списки условных обозначений. В зависимости от применимости реакции к данной таксономической группе, может указываться только положителный или отрицательный результат (например, запись «KOH+»/«KOH-» означает положительную/отрицательную реакцию со щёлочью) или указывается изменение окраски (например, «KOH+ желтеет»). Также указывается часть плодового тела или определённая микроструктура, если действие реагента неодинаково для разных структур гриба.

• Аммиак NH₃ или NH₄OH (25%-ный водный раствор или пары́ нашатырного спирта) у агариковых грибов даёт зелёное, реже жёлтое окрашивание, у других базидиомицетов может появляться розоватая, оливковая, фиолетовая, серовато-чёрная окраска. В лихенологии применяется редко.
• Анилин C₆H₅NH₂ применяется в чистом виде или в виде 50%-ной водной эмульсии, сокращённо обозначается «А». При положительной реакции у базидиомицетов даёт красноватое, медно-красное, жёлтое, жёлто-оранжевое, тёмно-коричневое или оливковое окрашивание.
• Ароматические диамины
  • Бензидин 4,4'-(C₆H₄NH₂)₂ в виде спиртового раствора даёт голубую окраску, свидетельствующую о наличии лакказы. Реагент является сильным канцерогеном, поэтому его на практике заменяют орто-толидином (диметилбензидином), который значительно менее опасен и даёт ту же реакцию, что было показано в работе Х. Клеменсона [Clemençon, Schweiz. Zeitschr. f.Pilzk., 1969, 47].
  • пара-Фенилендиамин 1,4-C₆H₄(NH₂)₂ может обозначаться как P или Pd, используется в виде 2 % спиртового или 1 % водного ратвора, в 1934 году этот реагент был введён в практику лихенологии Я. Асахиной. В присутствии кислорода воздуха растворы п-фенилендиамина быстро окисляются и приходят в негодность, поэтому перед использованием их проверяют на образце «оленьего мха» Cladonia rangiferina, который даёт интенсивную красную окраску. Для предохранения реактива от окисления в водный раствор добавляют 10 % сульфита натрия. Такой раствор, называемый реактивом Штейнера, сохраняется значительно дольше.
• Гваякол (спиртовой раствор или настойка семян растения Guajacum officinale) даёт окрашивание в голубовато-зелёные, голубовато-серые, оливковые или красно-коричневые тона.
• Концентрированные растворы кислот могут давать различные цветовые реакции, используются на свежем материале:
  • 60—70 % серная кислота,
  • 65 % азотная кислота,
  • 25 % соляная кислота,
  • Молочная кислота.
• Лактофенол — смесь равных частей молочной кислоты и фенола, при положительной реакции даёт окрашивание коричневых, розово-фиолетовых, лиловых, красноватых оттенков.
• Карболовая кислота (2,5 % раствор фенола) даёт красноватую, желтоватую, коричневую или фиолетовую окраску. Реакция считается положительной, если окраска появляется в течение 20 минут.
• α-Нафтол (водно-спиртовой раствор) окрашивает в фиолетовый или красноватый цвет, реакция проходит за 2—4 минуты.
• Пирамидон (водный раствор) даёт реакцию с окрашиванием в сиренево-фиолетовый цвет.
• Пирогаллол (спиртовой раствор) окрашивает в коричневые тона.
• Сульфованилин — раствор 1 г ванилина в смеси 8 мл концентрированной серной кислоты и 3 мл дистиллированной воды на свежем материале даёт окрашивание в пурпурные, коричневые, розово-фиолетовые цвета. Впервые применён Арнуольдом и Горисом в 1907 году.
• Сульфоформалин — смесь формалина и 60—70%-ной серной кислоты. Используется на свежем материале и на образцах, хранившихся в формалине не более 6 месяцев. При положительной реакции медленно появляется коричневое окрашивание.
• Феноланилин — смесь 3 капель анилина, 5 капель концентрированной серной кислоты и 10 мл карболовой кислоты. Положительная реакция заключается в появлении окраски ржаво-розового, пурпурно-красного или лилово-розового цвета, который затем переходит в шоколадно-коричневый.
• Формалин окрашивает в фиолетово-коричневый или красноватый цвет.
• 10 % раствор хлорида железа (III) даёт зеленоватое окрашивание, затем переходящее в тёмно-серый цвет.
• 10 % раствор сульфата железа (II) с добавлением серной кислоты окрашивает мякоть в зелёный, оливковый, оранжевый или коричневый цвет.
• Растворы щелочей (гидроксида калия или натрия) дают окрашивание в розовый, жёлтый, красно-коричневый или оранжевый цвет, реакция пригодна и для гербарного материала. Почернение бурой мякоти некоторых трутовиковых грибов под действием щёлочи называют ксантохроидной реакцией.

Макрореагенты

Реагенты — основания

Растворы щелочей (20-30 % раствор едкого натра (NaOH) или едкого кали (KOH)) и растворы аммиака (NH₄OH)

Specie	Parte che si colora	Come si colora
Russula foetens	Tutto	Crema-pallido
Russula subfoetens	Tutto	Giallo-cromo istantaneo
Bolelus sibiricus	Carne	Rosa

Nella seguente tabella sono riportate le principali reazioni con ammonio.

Specie	Parte che si colora	Come si colora
Boletus spadiceus	Cappello	Subito verde-azzurro
Cortinarius inamoenus	Carne	Giallo-vivo
Cortinarius latus	Carne	Giallo-vivo
Cortinarius largus	Carne	Giallo-vivo
Cortinarius variecolor	Carne	Giallo-vivo
Cortinarius nemorensis	Carne	Giallo-vivo
Cortinarius balteatus	Carne	Bruna a bordo giallo
Cortinarius subbalteatus	Carne	Bruna a bordo giallo
Cortinarius balteatocumatilis	Carne	Bruna a bordo giallo
Cortinarius crassus	Carne	Bruna a bordo giallo
Cortinarius pseudocrassus	Carne	Bruna a bordo giallo
Cortinarius balteatoalbus	Carne	Bruna a bordo giallo
Cortinarius orichalceus	Carne	Verde
Cortinarius prasinus	Carne	Verde
Cortinarius xanthophyllus	Carne	Verde
Cortinarius dibaphus	Carne	Rosa-rosso
Cortinarius arcuatorum	Carne	Rosa-rosso
Cortinarius fulvoincarnatus	Carne	Rosa-rosso
Phylloporus rodoxanthus	Carne	Blu
Lepiota badhamii	Lamelle	Verdi
Lactarius turpis	Carne	Porpora
Russula sardonia	Tutto	Rosa
Russula virescens	Base del Gambo	Rosso-arancio
Botetus satanas	Pori	Verdastri
Russula cavipes	Tutto	Rosa

Кислоты

Растворы серной кислоты (H₂SO₄) и азотной кислоты (HNO₃)

Specie	Parte che si colora	Come si colora
Boletus plorans	Pori	Gialli
Boletus subtomentosus	Carne	Rosso

Соли железа

• Растворы солей Fe(II): (FeSO₄), in cristalli o in soluzione acquosa al 10 % è impiegato per le Russule;
• Растворы солей Fe(III): (Fe₂Cl₆), in soluzione acquosa al 20 %, è impiegato con i Cortinari.

Specie	Parte che si colora	Come si colora
Amanita pantherina var. abietum	Carne	Grigio-verde poi rosa, infine rosso-bruno
Clitocybe connata	Lamelle	Violette
Lactarius volemus	Carne	Verde
Russula vesca	Tutto	Ocra-arancio vivace
Russula grisea	Tutto	Rosa-arancio
Russula alutacea	Tutto	Arancio
Russula aurata	Tutto	Giallo-arancio debole
Russula delica	Tutto	Giallo-arancio
Russula nigricans	Tutto	Verde scuro
Russula albonigra	Tutto	Rosa-Carnernicino chiaro
Russula adusta	Tutto	Arancio, poi oliva
Russula agrifolia	Tutto	Arancio pallido, poi grigio-verde
Russula densifolia	Tutto	Verde-oliva
Russula mustelina	Tutto	Arancio-bruno vivo
Russula medullata	Tutto	Arancio-pallido
Russula ochroleuca	Tutto	Arancio-pallido
Russula luteotacta	Tutto	Grigio-arancio debole
Russula pseudointegra	Tutto	Ocra-pallido
Russula liliacea	Tutto	Rosso-pallido
Russula chamaleontina	Tutto	Grigiastra
Russula vitellina	Tutto	Rosa
Russula font-queri	Tutto	Giallo-arancio
Russula nauseosa	Tutto	Rosa
Russula faginea	Tutto	Verde istantaneo
Russula xerampelina	Tutto	Verde-scuro intenso
Russula graveolens	Tutto	Verde-scuro
Russula cicatricata	Tutto	Verde-bronzo
Russula cerulea	Tutto	Arancio
Botetus oxidabile	Carne	Verde-giallo
Boletus holopus	Carne	Grigia
Boletus duriusculus	Carne	Verde-scuro
Botetus scaber	Carne	Grigio-blu
Boletus griseus	Carne	Verde-scuro o grigio-azzurra
Russula heterophylla	Tutto	Rosa-arancio
Russula olivacea	Tutto	Arancio-vivo
Russula rubroalba	Tutto	Giallo-arancio
Russula romellii	Tutto	Arancio-pallido
Russula amoenicolor	Tutto	Arancio-pallido

Реактив с таллием (Tl-4)

È impiegato per lo studio dei Cortinari ma dà reazioni utili anche con altri funghi. Il Tl-4 si prepara come segue: si scioglie 1g di ossido di tallio in acido nitrico (4 cc) e acido cloridrico concentrati (4 cc), alla soluzione si aggiunge, un po' alla volta e osservando la massima cautela, 1 g di bicarbonato di sodio. Se positive da colorazioni gialle, rosse, verdastre o viola.

Фенол

2 % раствор фенола

Specie	Parte che si colora	Come si colora
Amanita pantherina	Carne	Rosso-vinato
Amanitopsis fulva	Carne e Gambo	Bruno-cioccolato
Amanitopsis crocera	Carne e Gambo	Rosso-vinoso
Russula integra	Tutto	Bruno-cioccolato
Russula olivacea	Tutto	Viola-porpora vivace
Russula rubroalba	Tutto	Rosso-scuro
Russula curtipes	Tutto	Bruno-chiaro
Russula romellii	Tutto	Bruno-ciccolato
Russula pseudodelica	Tutto	Bruno-lilla
Russula amoena	Tutto	Violetto-vinato
Russula amoenicolor	Tutto	Bruno-vinato lento
Russula violeipes	Tutto	Bruno-cioccolato lento
Russula ilicis	Tutto	Bruno-porpora

Анилин

L’olio di anilina passato sulla cuticola permette di distinguere i prataioli in due grossi gruppi, a seconda se reagiscono in giallo o no. La traccia dell’anilina intersecata con una di acido nitrico concentrato può dare un’importante reazione, colorata in giallo arancio, denominata «reazione incrociata di Schaeffer». Mescolando qualche goccia di olio di anilina in acqua si ottiene l’acqua di anilina, un reattivo importante per le Russule.

«Феноланилин»

È un reagente impiegato per saggio sui Cortinari e se positiva da reazioni lente con colorazioni rosse. Si prepara aggiungendo 3 gocce di olio di anilina a 5 gocce di acido solforico concentrato e mescolando il tutto con 10 ml di fenolo al 2 %.

Раствор Люголя

Soluzione acquosa iodata impiegata per individuare i funghi con carne o elementi amiloidi, cioè che reagiscono in blu-viola come l'amido. È composto da 1 g di iodio , 2 g di ioduro di potassio (KI) sciolti in 150—200 ml di acqua distillata. È utilizzato per saggi sui Cortinari.

Reattivi fenolossidasici

Non sono sempre specifici, ma danno delle reazioni colorate con la carne dei funghi.

Specie	Parte che si colora	Come si colora
Russula heterophylla	Tutto	Bruno-scuro
Russula virescens	Tutto	Rosso-vinoso intenso
Russula pseudodelica	Tutto	Blu-verde
Russula violeipes	Tutto	Blu-verde
Russula fragilis	Tutto	Verdastra
Russula rhodopoda	Tutto	Blu-nero intenso
Russula unicolor	Tutto	Blu-vivace

Другие методики

Тест на амилоидность

Амилоидностью называют способность структур окрашиваться под действием растворов иода. Обычно применяется реактив Мельцера: к водному раствору, содержащему 2,5 % иода и 7,5 % иодида калия добавляют равный объём хлоралгидрата. Реакция применяется как макроскопическая и для окрашивания препаратов при микроскопировании, что даёт возможность определить амилоидность различных структур: спор, гиф, базидий. Амилоидность проявляется и у образцов, длительное время (более 100 лет) хранившихся в гербарии (по данным Зингера, 1975). Наличие и степень амилоидности позволяет определить особенности строения молекул глюканов — полисахаридов, сходных с крахмалом, а также мощность глюканового слоя на поверхности микроскопических структур гриба. Иод адсорбируется в случае сильно развитого поверхностного слоя в каналах между глюкановыми цепочками. Если цепочки сильно разветвлённые, реакция даёт жёлто-коричневую окраску, при наличии менее разветвлённых цепочек проявляется собственно амилоидная реакция — интенсивное посинение, аналогичное известной в аналитической химии иодокрахмальной реакции. Обычно различают структуры неамилоидные (не окрашиваются), декстриноидные, или псевдоамилоидные (окрашиваются в жёлтые и коричневые тона) и амилоидные (окрашиваются в голубой, синий, до почти чёрного).

В 2005 г. В. А. Спириным и соавторами предложено определять степени градации этой реакции в соответствии со шкалой цветов (в скобках — обозначение цвета по шкале Й. Петерсена [Petersen, 1996]):

• слабодекстриноидная — от бледно-коричневого (P14) до бледно-оливкового (P16)
• декстриноидная — желтовато-бурый (P9)
• сильнодекстриноидная — оранжево-бурый (P7)
• неясно-амилоидная — от бледно-мышино-серого (P53) до бледно-фиолетово-серого (P59)
• слабоамилоидная — мышино-серый (P55)
• амилоидная — от голубовато-серого (P57) до тёмно-голубовато-серого (P56)
• сильноамилоидная — от винно-серого (P58) до серовато-фиолетового (P44)

Реакция Шеффера

Перекрёстная реакция Шеффера: стеклянной палочкой наносят на срез полоску раствора анилина, а затем, пересекая её, полоску 65%-ной азотной кислоты. При положительной реакции в месте пересечения появляется хромово-жёлтое пятно, затем окраска переходит в оранжево-красную. Реакция Шеффера — важный внутриродовой признак для рода Agaricus. Пригодна для материала, длительно хранившегося в гербарии. Открыта Ю. Шеффером в 1933 г.

Красители для микроскопии

Окрашивание органическими красителями применяется как для улучшения оптических свойств микроскопических препаратов, так и для характеристики окрашенных структур. Например, при окрашивании толуидиновыми красителями (крезил синий) различают цианофилию — синеватое окрашивание и метахромазию — красновато-розовое или красновато-фиолетовое окрашивание.

Литература

• Окснер А. Н. Морфология, систематика и географическое распространение. — Л.: «Наука», 1974. — 284 с. — Определитель лишайников СССР. Вып.2.^{о книге}
• Дудка И. А., Вассер С. П., Элланская Э. А. и др. Методы экспериментальной микологии. Справочник. — Киев: «Наукова думка», 1982. — С. 59, 474—477.^{о книге}
• Вассер С. П. Флора грибов Украины. Агариковые грибы. — Киев: «Наукова думка», 1980. — С. 43—55.^{о книге}
• Змитрович И. В. Семейства ателиевые и амилокортициевые. — М. — СПб.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. — С. 24—25. — Определитель грибов России. Порядок афиллофоровые; Выпуск 3. — ISBN 978-5-87317-561-1^{о книге}